Cada fita separada funciona, agora, como molde para a produção de uma fita complementar. Com auxílio de uma enzima chamada polimerases, as bases nitrogenadas vão pareando-se com sua base complementar: Timina com Adenina e Citosina com Guanina. Após o processo de pareamento das bases, duas novas moléculas de DNA se formam, inteiramente novas. Portanto, a duplicação do DNA é semiconservativa, ou seja, em cada nova molécula formada, um filamento é o original e outro filamento é o novo.
Primeiro passo para ocorrer a autoduplicação do DNA é o “desenrolamento” da dupla hélice, separando-se os pares de bases complementares de cada fita. Isso é feito com auxílio de enzimas, que promovem a quebra das pontes de hidrogênio que unem os pares de bases.